Bases Purinas E Pirimidinas

O que você precisa saber antes de ligar o espectrofotômetro

A determinação de concentração de ácidos nucleicos por absorbância em 260 nm é o padrão da indústria, mas a leitura cru sem saber o que está medindo pode te dar erros de até 40%. As bases purínicas — adenina e guanina — e as bases pirimídicas — citosina, timina e uracila — absorvem luz UV porque os seus anéis aromáticos conjugados permitem transições eletrônicas *. Esse é o princípio básico, mas o que a maioria das pessoas esquece é que a absorbância não mede apenas as bases isoladas. Ela mede toda a estrutura eletrônica do nucleotídeo, incluindo o efeito do açúcar e do fosfato no microambiente local. Eu trabalho com extração de DNA e RNA há anos e já vi gente usar a famosa regra de que 1 OD260 = 50 µg/mL para DNA fita dupla e 40 µg/mL para RNA sem jamais questionar se aquela amostra era pura. O problema é que contaminantes comuns como fenol, proteínas e sais alteram a absorbância de formas diferentes. Fenol absorve fortemente perto de 270 nm e empurra a relação A260/A280 para baixo. Proteínas arrastam a A280 junto. Sais não afetam muito a absorbância em si, mas baixam a condutividade e podem interferir na calibração do espectrofotômetro se estiver usando cuvetas de plástico reutilizáveis. O cálculo da concentração mesmo é simples. Você mede a absorbância da amostra em 260 nm, subtrai o branco (água TE ou eluição), e aplica o fator de diluição multiplicado pela constante correspondente. Para DNA ss, 1 OD260 = 33 µg/mL. Para DNA ds, 50 µg/mL. Para RNA, 40 µg/mL. Para oligonucleotídeos, você calcula pelo peso molecular exato usando a soma das massas dos monofosfatos de cada base mais o açúcar e o fosfato terminal, ajustando para a cadeia única. Esse último ponto é onde muita gente erra — usar o fator de 33 µg/mL para um oligo de 20 mers pode dar um erro de concentração de 15 a 20% dependendo do conteúdo GC.

Um caso específico que me deu trabalho foi com amostras de tecido fibroso onde o glicogênio residual co-precipitou com o DNA. O glicogênio não absorve em 260 nm, então a absorbância parecia normal, mas quando eu testava a amostra em gel, a migração ficava distorta e a quantidade real de DNA era metade do que a leitura indicava. A solução foi fazer uma precipitação adicional com acetato de sódio 3M etanol a 100% gelado, lavando o pelet com etanol 70% duas vezes. Isso removeu o glicogênio e corrigiu a leitura. O tempo total gasto foi cerca de 30 minutos adicionais por amostra, mas evitou refazer toda a série de experimentos downstream. A relação A260/A280 é o indicador clássico de pureza, mas ela sozinha não conta tudo. DNA puro deve estar entre 1,8 e 2,0. RNA puro entre 2,0 e 2,2. Se você pega uma amostra de DNA com A260/A280 de 1,6, pode ser proteína, mas também pode ser contaminante de fenol ou mesmo DNA degradado com muita extremidade 5' fosforilada livre que interfere na leitura. O A260/A230 complementa — valores ideais ficam acima de 2,0 para ambas as razões. Abaixo de 1,8 nessa razão geralmente indica contaminação por fenóis, cloreto de guanidina ou carboidratos. Outro detalhe que pouca gente leva a sério é o efeito do pH. A absorbância das bases purinas e pirimidinas varia com o pH porque o estado de protonação dos nitrogênios nos anéis afeta a conjugação eletrônica. Em pH ácido, a adenina e a guanina se protonam, deslocando o pico de absorbância e aumentando levemente a eficiência quântica da absorção. Em pH alcalino, o RNA se hidrolisa rapidamente e as bases liberadas têm perfis de absorbância diferentes dos nucleotídeos intactos. Sempre meça em pH neutro, idealmente em TE 1x (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). A questão é que muitos laboratórios usam água nuclease-free para diluir as amostras, e a água pura tem pH instável que pode variar de 5 a 8 dependendo da exposição ao CO2 do ar. Essa variação de pH muda a absorbância em cerca de 2 a 3%, o que em amostras de baixa concentração pode significar a diferença entre detectar ou não o alvo.

Se você trabalha com sequenciamento de nova geração, a quantificação por fluorometria (Qubit, PicoGreen) substituiu praticamente a espectrofotometria para a maioria das aplicações, porque fluorescência é específica para DNA ou RNA e não reage a contaminantes. Um equipamento desses custava algo em torno de R$ 30.000 a R$ 60.000 na época, com kits de R$ 2.000 a R$ 4.000 por 100 leituras. Vale o investimento se você faz quantificação frequente, porque a reprodutibilidade melhora drasticamente — desvio padrão caindo de cerca de 12% para cerca de 3% nas medições de DNA ds. O espectrofotômetro ainda tem seu lugar, principalmente para diagnóstico rápido de pureza e para amostras onde o volume é limitado a 1 ou 2 µL, como em plataformas NanoDrop. Mas saiba que aNanoDrop estima concentração baseada na mesma lei de Beer-Lambert e enfrenta os mesmos problemas de contaminação. O equipamento compensa com caminho óptico curto (0,5 mm), o que permite medir amostras muito concentradas sem diluição excessiva. Para oligonucleotídeos sintéticos, a absorbância em 260 nm é calculada a partir da lista de sequências usando a soma das contribuições molares de cada base em fase desprotonada. O valor molar absorptividade de cada monofosfato em pH 7,0 é aproximadamente: dA = 15.400 M¹cm¹, dG = 11.500, dC = 7.400, dT = 8.700. Some todos, aplique a absorbância medida e inverta para achar a concentração molar. É mais preciso do que usar o fator genérico de 33 µg/mL, especialmente para primers curtos onde o conteúdo de GC define se você está superestimando ou subestimando em dezenas de por cento.