Exercicio Acidos Nucleicos

Ácidos nucleicos na prática de laboratório

Quem já trabalhou com ácido nucleico sabe que o processo não é tão simples quanto o protocolo manda. O primeiro erro mais comum é subestimar a qualidade da amostra. Se você está isolando DNA ou RNA de tecido fresco, o rendimento costuma ser razoável, mas de amostras parafinadas ou sanguíneas antigas, a coisa muda completamente de figura. A integridade do material é o que dita se o exercício vai dar certo ou se você vai passar a tarde inteira tentando consertar uma reação que já nasceu morta. A diferença entre DNA e RNA é mais do que semântica. O RNA é instável, sensível a RNases que estão em toda parte — na pele, no ar, nas superfícies. Já o DNA aguenta bastante abuso antes de começar a degradar. Se o seu exercício pede extração de RNA, use luvas, água livre de RNase e, de preferência, um kit que tenha etapa de lise rápida. Eu já perdi três dias de trabalho porque deixei um tubo de RNA exposto no bico de Bunsen por acidente. UmaRNase residual e é isso. O gel mostra faixas borradas, quantificação dá valores esquisitos, e o diagnóstico molecular simplesmente não funciona.

Exercicio acidos nucleicos passo a passo

Para um exercício prático, comece pelo isolamento. O método de fenol-clorofórmio ainda é válido, especialmente se você precisa de DNA de alta pureza para sequenciamento. O protocolo básico envolve lisar a célula, precipitar as proteínas com fenol, separar as fases com clorofórmio e recuperar o ácido nucleico na fase aquosa com etanol. O rendimento varia muito dependendo do volume inicial e do tipo de tecido. Em média, de 100mg de fígado, você espera algo entre 2 a 5 microgramas de DNA puro, com leitura 260/280 em torno de 1,8. Se cair abaixo de 1,6, há contaminação proteica. Se passar de 2,0, pode ser RNA residual. Já para RNA, o método TRIzol é o mais usado em exercícios de graduação. Ele é simples, rápido, e funciona para a maioria dos tecidos moles. O problema é que o TRIzol é tóxico e exige ventilação. Eu já vi aluno que fez a extração em bancada aberta e ficou com tontura na hora. Não vale o risco. Use capela, de preferência, e descarte os resíduos conforme as normas do laboratório. O rendimento de RNA total costuma ficar entre 0,5 a 2 microgramas por 100mg de tecido, dependendo da ricidade em ribossomos do tecido em questão. Tecido hepático e pancreático rendem mais; tecido adiposo rende pouco e é cheio de lipídios que atrapalham. Após a extração, o exercício normalmente pede análise por eletroforese em gel de agarose. Para DNA, use gel 0,8% a 1,2%. Para RNA, 1% a 1,5% com formulário de formaldeído ou algo equivalente, senão a mobilidade fica distorcida. A coloração com brometo de etídio ou SybrSafe funciona, mas o etídio é mutagênico. Se o laboratório permitir, SybrSafe é mais seguro e tão sensível quanto. Corra o gel em TAE 1x, 100 volts, 30 a 40 minutos. O resultado esperado para DNA genômico inteiro é uma faixa única e nítida acima de 10kb. Se aparecer um smear descendente, houve degradação. Para RNA, as bandas 28S e 18S devem estar em proporção 2:1. Se a 28S estiver mais fraca, o RNA degradou durante a extração ou armazenamento.

Dosagem espectrofotométrica é obrigatória. Um NanoDrop rápido te dá a concentração e as razões 260/280 e 260/230. A 260/230 fica entre 2,0 e 2,2. Valores baixos indicam contaminação com fenol, sal ou etanol residual. Se seu exercício pede qPCR depois disso, essa etapa é crítica. Contaminantes inibem a Taq polymerase e você pode ter Ct values altos ou até falha total de amplificação. Eu tive um caso em que todas as amostras de um exercício deram Ct 38, com curva de amplificação plana. A solução foi diluir 1:10 em água nuclease-free e repetir. Se ainda sim fracassar, refaça a extração. Se o exercício incluir digestão com enzimas de restrição, tome cuidado com o buffer. Cada enzima tem seu buffer ideal, e usar o errado reduz a atividade significativamente. A enzima EcoRI, por exemplo, funciona bem em CutSmart, mas em buffer padrão de TAE puro a atividade cai quase pela metade. Isso é algo que muitos exercícios básicos não mencionam, e o aluno fica sem entender porque a digestão não completou. Sempre controle positivo e negativo. Um tube com DNA conhecido e enzima conhecida valida o lote da enzima. Clonagem é outra possibilidade em exercícios mais avançados. Nesse caso, a ligatura depende da proporção inserto:vetor, que geralmente fica em 3:1 molar. Muitos alunos calculam em massa e erram porque esquecem que fragmentos menores têm mais mols por micrograma. Um inserto de 500bp e um vetor de 5kb na mesma massa dão razão molar de 1:10 a favor do vetor. A ligatura falha. Calcule sempre em mols, não em ng. A T4 DNA ligase funciona melhor em 16°C por 1 hora ou em RT por 10 minutos, dependendo do kit. Ligate overnight funciona, mas é desnecessário na maioria dos casos e aumenta a probabilidade de autofligação do vetor.

Transformação em competentes é a parte mais sensível do exercício. Células BL21 ou DH5, choque térmico a 42°C por exatos 45 segundos, recuperação em SOC a 37°C por 1 hora com agitação. Se o choque for mais curto, a eficiência cai. Se for mais longo, a viabilidade cai. Eu já vi aluno que fez 90 segundos de choque e quase não teve colônias. O plasmídeo entra, mas a célula morre. A recuperação em SOC é obrigatória, nunca use LB simples. O SOC tem glicose e nutrientes extras que ajudam a célula a recuperar a parede após o estresse do cálcio. Placas com antibiótico devem ser incubadas a 37°C, 150rpm, overnight. O tempo de incubação varia com a cepa e o plasmídeo. Vetores de cópia alta dão colônias em 12 horas; vetores de cópia baixa podem levar 16 a 18 horas. Se o exercício pede miniprep, faça o lise alcalina correto: solução I ressuspenda bem o pellet, solução II adicione e misture suavemente sem vortexar — vortexar causa quebra do DNA genômico e contamina a prep. Solução III neutra, centrifuga, sobrenadante vai para etanol 70% gelado. O precipitado de DNA deve ficar visível como um filamento branco. Seca bem, mas não deixe ressecar demais, senão o DNA não redissolve. Redissolução em 30 a 50 de TE ou água livre de DNase. Incube 10 minutos a RT. Vórtex leve. Armazene a -20°C. Para exercícios que pedem sequenciamento Sanger, a concentração ideal é 50 a 100ng/ em volume de 8, com primer específico a 3,2pmol/. Se o sequenciador reclamar de sinal fraco, é provável que a prep esteja ruim ou o primer não está hibridando corretamente. Refaça a prep com controle de pureza no NanoDrop antes de enviar.

O exercício também pode envolver síntese de cDNA a partir de RNA total, usando reverse transcriptase. A escolha do primer faz diferença. Oligo-dT captura polyA tail, ideal para mRNA eucariótico. Random hexamers capturam qualquer RNA, incluindo rRNA e tRNA, útil para transcripts sem polyA ou para samples com RNA degradado. Primer específico é o mais sensível, mas só funciona se você souber a sequência-alvo. Eu prefiro random hexamers para exercícios gerais, porque cobre mais terreno. A reação de RT deve ser feita a 42-50°C por 30-60 minutos, seguida de inativação a 70°C por 10 minutos. Se pular a inativação, a enzima continua ativa e pode degradar o cDNA em reações subsequentes. PCR é, sem dúvida, a etapa mais comum. A composição da mistura deve ser calculada para volume final de 20-50. Tampão 1x, MgCl2 1,5-2,5mM, dNTPs 200M cada, primers 0,2-0,5M cada, Taq 1-2 unidades, template 50-200ng de DNA ou 10-100ng de cDNA. ciclros padrão: 95°C 30s, 55-65°C 30s, 72°C 30s/kb, 30-35 ciclos. A temperatura de annealing é o fator mais crítico. Se estiver baixa, primer-dimers e não-specific bands aparecem. Se estiver alta, o rendimento cai drasticamente. Faça um gradiente se possível. Um gradiente de 5 ciclos com diferença de 2°C entre eles resolve a maioria dos problemas de otimização em tempo recorde. Eletróforese pós-PCR usa gel 1,5% a 2% para fragmentos pequenos (100-500pb) e 1% para fragmentos maiores. Marcador de peso molecular é obrigatório. Sem ele, você não sabe se a banda está no tamanho esperado. Corra o gel até a corante frente chegar a 1cm da borda inferior. Se correr demais, os fragmentos pequenos escapam do gel. Se correr de menos, a resolução é pobre. Estaque com 100V por 30-45 minutos para gels pequenos, até 150V para gels maiores.

Um problema comum em exercícios acadêmicos é a presença de inhibidores de PCR em amostras biológicas diretas, como sangue total ou fezes. O sangue contém hemoglobina e heparina, que inibem a Taq. A solução é lavar o pellet de DNA com etanol 70% duas vezes após a precipitação, ou diluir o template 1:20 antes de montar a reação. Fezes precisam de tratamento com bead-beating e purified com kit específico de solo/stool, senão os polissacarídeos e fenóis vegetais inibem completamente a PCR. Eu já perdi duas rodadas de exercício porque não lavei bem o DNA de amostras fecais. Os Ct values eram indefinidos e o professor achava que era erro de pipetagem. Na verdade, era puro inibidor. Armazenamento de ácidos nucleicos também merece atenção. DNA puro em TE a -20°C dura anos sem degradação significativa. RNA puro deve ser armazenado em aliquote a -80°C, nunca ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Cada ciclo reduz a integridade. Se você não tem -80°C, work at 4°C e use o RNA em poucos dias. DNA em água livre de DNase pode precipitar se a concentração for muito baixa, abaixo de 10ng/. Nesse caso, adicione 0,1 volumes de acetato de sódio 3M pH5,2 e precipite novamente com etanol. O exercício de ácidos nucleicos, quando bem executado, ensina muito mais do que apenas pipetar. Ensina paciência, leitura crítica de resultados, e capacidade de troubleshooting. A maior lição que eu levei da bancada foi: nenhum protocolo é universal. O que funciona para fígado pode falhar para pele. O que funciona para DNA pode não funcionar para RNA. O laboratório é um exercício constante de adaptação, e a teoria do livro é apenas o ponto de partida.