Fator Antinuclear Placa Metafásica Cromossômica Reagente

Como preparar e usar placas metafásicas cromossômicas para detecção de fatores antinucleares

A técnica de imunofluorescência indireta com células em metáfase é uma das formas mais sensíveis de detectar anticorpos antinucleares, especialmente aqueles contra constituintes cromossômicos que passam despercebidos em substratos convencionais de HeLa ou HEp-2 em interfase. O procedimento é simples na teoria, mas exige controle rigoroso de cada variável se você quer resultados reprodutíveis. Vou descrever o processo do zero, incluindo um problema real que enfrentei recentemente e como contornei. O primeiro passo é o cultivo celular. Você precisa de células que estejam se dividindo ativamente. O mais comum é usar linfócitos humanos estimulados com fitohemaglutinina (PHA) ou linhagens como HEp-2 cultivadas até atingir fase de crescimento exponencial. O segredo não é apenas ter células se dividindo, mas sincronizá-las parcialmente para aumentar a proporção de células em metáfase no momento da coleta. Na prática, eu uso colcemida (0,1 µg/mL) por 30 a 45 minutos antes da coleta. Tempo insuficiente e você terá poucas metáfases espalhadas; tempo excessivo e os cromossomos ficam condensados demais, com cromátides sobrepostas que dificultam a análise de padrões de fluorescência.

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Depois da exposição à colcemida, faz-se a hipotonização com KCl a 0,075 M por 10 a 15 minutos a 37°C. Esse é um ponto onde muitos erram. A solução hipotônica precisa estar preta e fresca. Se estiver velha ou contaminada, as células não incham corretamente e os cromossomos ficam compactados em massas irreconhecíveis. Já perdi duas plaquetas inteiras por usar KCl que havia sido preparado há mais de duas semanas e armazenado sem controle de pH. O fixação segue com metanol gelado ou fixador de Carnoy (metanol/ácido acético 3:1). Você adiciona o fixador gota a gota enquanto suspende o pellet celular, e então deixa agir por alguns minutos. A montagem nos slides é a etapa mais crítica. O spread das metáfases precisa ter cromossomos bem separados, com boa resolução individual. Se estiver usando microscópio de fluorescência com objetiva de imersão em óleo 63x ou 100x, cada cromossomo deve ser distinguível. No laboratório, eu descarto preparações onde mais de 30% das metáfases têm cromátides sobrepostas. Para a detecção do fator antinuclear, o protocolo padrão de imunofluorescência indireta aplica o soro do paciente diluído (comece com 1:40 ou 1:80) sobre os slides fixados, incuba por 30 minutos em câmara úmida a 37°C, faz os baños de lavagem com PBS-Tween 0,05%, e então aplica o anticorpo secundário conjugado a FITC ou TRITC anti-human IgG/IgA/IgM diluído conforme o fabricante. O tempo de incubação do secundário varia entre 20 e 30 minutos. A montagem com meio de montagem com antifading e a leitura ao microscópio de fluorescência completam o procedimento.

O que diferencia essa abordagem do IF convencional em interfase é o padrão de staining. Em metáfase, os anticorpos contra cromatina, centrômeros, condensinas e proteínas do fuso mitótico produzem padrões extremamente definidos. Um paciente com síndrome de Sjögren, por exemplo, pode ter ANA negativo em HEp-2 interfase e positivo nessa técnica, revelando anticorpos anti-cromatina ou anti-histonas com padrões de bandamento cromossômico que são diagnosticamente relevantes. Já vi casos de lúpus com padrão de staining pontuado ao longo dos braços cromossômicos que só se tornaram evidentes nesse substrato. Um problema prático que recentemente: após três meses usando um lote novo de reagente de colcemida de um fornecedor diferente, as metáfases simplesmente não "abriam" corretamente na hipotonização. Os cromossomos ficavam todos aglomerados no centro do slide. Descobri que o novo lote tinha concentração ligeiramente diferente do declarado, e o tempo padrão de 30 minutos era insuficiente. Ajustei para 50 minutos e adicionei uma verificação prévia com Giemsa em um slide de teste antes de prosseguir com toda a placa. Isso me custou dois dias extras, mas evitou desperdiçar reagentes caros de IF em uma preparação inutilizável. Outro detalhe que poucos mencionam: a qualidade do fixador é mais importante do que a do soro. Slides mal fixados perdem os antígenos durante as lavagens com tampão. Se o padrão de fluorescência parecer fraco ou irregular mesmo com controles positivos funcionando, o primeiro lugar para investigar é o fixador e o tempo de fixação, não a diluição do soro do paciente. Slides fixados há mais de duas semanas perdem sinal progressivamente, especialmente para anticorpos anti-histona e anti-DNA.

Os reagentes necessários incluem: meio de cultura adequado (RPMI 1640 com 10% de SBF), PHA para estimulação, colcemida, KCl hipotônico, fixador, slides de vidro cromatográfico ou lisos tratadas, soro do paciente, anticorpo secundário anti-Ig humana conjugado a fluoróforo, e meio de montagem com antifading. Existem também kits comerciais que fornecem células em metáfase prontas para uso, o que elimina a etapa de cultivo mas reduz seu controle sobre a qualidade do spread. O custo por slide pronto pode ser de 3 a 5 vezes maior do que produzir internamente. A leitura dos padrões requer familiaridade. Em interfase, os padrões são mais intuitivos: homogêneo, periférico, nucleolar, etc. Em metáfase, você precisa interpretar staining ao longo dos braços cromossômicos, nos cinetócoros, no corpúsculo de Dirks, na placa equatorial. Um padrão de staining intenso nos centrômeros de todas as metáfases é altamente sugestivo de anticorpos anti-centrômero, clássico na esclerodermia sistêmica limitada. Um padrão que percorre todo o comprimento dos cromossomos sugere reatividade contra histonas ou DNA. A superposição de padrões é comum e exige análise cuidadosa. Não recomendo essa técnica como triagem inicial de ANA. Ela é complementar. O fluxograma padrão é: triagem com IF em HEp-2 interfase, e se positivo ou suspeito clinicamente, encaminhar para a placa metafásica cromossômica para caracterização do padrão e detecção de autoanticorpos contra alvos mitóticos. O tempo total do procedimento, do cultivo à leitura, varia de 48 a 72 horas para preparação dos slides, mais 2 a 3 horas para a execução do IF em si. Se já tiver os slides prontos, o teste em si leva cerca de 1 hora e meia, desde o momento da aplicação do soro até a leitura final.

Uma limitação importante que precisa ser dita claramente: a técnica não é padronizada entre laboratórios. Diferentes protocolos de cultivo, fixação e diluição produzem resultados que podem variar significativamente. Isso significa que valores de titulação e interpretação de padrões têm validade principalmente intra-laboratorial. Se você está estabelecendo o método, gaste pelo menos duas semanas calibrando com soros de controle conhecidos antes de começar a testar pacientes. E mantenha registro fotográfico dos padrões de referência para cada lote de reagentes.