No Cruzamento Entre Dois Individuos Diibridos

Cruzamento diíbrido: o que acontece quando os genes não trocam de lugar

Ao ensinar genética no ensino médio e nos primeiros semestres de graduação, eu sempre comecei pelo clássico 9:3:3:1 de Mendel. Mas quando os alunos chegam com resultados experimentais que não fecham, a primeira coisa que eu pergunto é: os dois genes estão no mesmo cromossomo, e se sim, qual a distância entre eles. A resposta determina se o cruzamento entre dois indivíduos diíbridos vai produzir proporções mendelianas ou se vamos precisar modelar linkage com coeficiente de recombinação. Vou ser direto: se você está trabalhando com mapeamento gênico ou construindo linhas puras de uma planta ou animal, ignorar a possibilidade de linkage entre dois loci é o erro mais caro que existe. Eu já perdi três semanas acompanhando uma geração F2 inteira porque assumi independência mendeliana para dois marcadores que estavam a 8 cM um do outro no mesmo cromossomo. O resultado? Uma distribuição fenotípica que parecia "ruim" mas na verdade estava perfeitamente correta — só não era mendeliana. O conceito-chave aqui é que o cruzamento diíbrido tradicional pressupõe que os alelos de dois genes diferentes segregam independentemente durante a meiose. Isso ocorre quando os genes estão em cromossomos diferentes, ou quando estão no mesmo cromossomo mas suficientemente distantes para que o crossing-over aconteça com frequência suficiente para simular independência estatística. Na prática, a distância de 50 cM é o limiar: acima disso, os genes se comportam como se estivessem em cromossomos diferentes, e abaixo disso, a desproporção de recombinantes versus parentais começa a ficar evidente.

Quando digo que não há cruzamento entre dois indivíduos diíbridos, o que normalmente significa é que estamos lidando com linkage completo ou quase completo entre dois loci. Nesse cenário, os gametas produzidos pelo diíbrido heterozigoto (por exemplo, AaBb) não seguem a proporção 1:1:1:1 esperada para gametas AB, Ab, aB, ab. Em vez disso, os gametas parentais (os que carregam as combinações de alelos que vieram dos pais originais) aparecem com muito mais frequência que os gametas recombinantes.

Como identificar se há linkage entre os dois genes que você está analisando

O teste qui-quadrado de independencia é o primeiro passo, mas eu sempre recomendo olhar os dados brutos antes de confiar cegamente no p-valor. Quando eu estava analisando dados de cruzeiros de Drosophila melanogaster com os genes body e vestigial, o qui-quadrado deu p

0.001, o que rejeitava a independencia. Mas o que realmente me ajudou foi calcular a frequencia de recombinantes diretamente: (numero de recombinantes)/(numero total de progenie). Esse calculo me deu uma distancia de aproximadamente 18 cM, que corresponde bem ao mapa genético conhecido para esses dois loci no cromossomo II. O metodo pratico que eu uso desde então é o seguinte. Primeiramente, monte o quadrado de Punnett considerando linkage, nao independencia. Se os genes estiverem acoplados em cis (AB/ab), os gametas parentais AB e ab serao produzidos com frequencia muito maior que Ab e aB. Se estiverem em trans (Ab/aB), a situacao e inversa. O coeficiente de recombinaçao (r) e simplesmente a proporcao de gametas recombinantes, e varia de 0 (linkage completo) a 0.5 (independencia absoluta). Para estimar r experimentalmente, conte os individuos recombinantes na progenie e divida pelo total. Se r for menor que 0.5, voce tem linkage. Quanto menor r, mais proximos os genes estao no mesmo cromossomo. Uma regra pratica que funciona na maioria dos casos e que voce pode estimar a distancia em cM multiplicando r por 100, embora essa linearidade deixe de valer para distancias maiores que 20 cM devido a eventos multiples de crossing-over.

Quando o linkage completo ocorre e como lidar com isso

No linkage completo, r = 0, e os genes estao to proximos que nunca ocorre crossing-over entre eles. Nesse caso, um indivduo diíbrido produce apenas dois tipos de gametas, nao quatro. Se o genotipo for AB/ab, os gametas serao AB e ab na proporcao 1:1. Se voce fizer um cruzamento testcross (AB/ab x ab/ab), a progenie sera 1 AB/ab : 1 ab/ab, sem nenhum recombinante. Isso e facil de identificar: basta observar que nenhum fenotipo recombinante aparece na progenie. Um problema pratico que eu encontrei varias vezes e que merece atencao: o linkage completo so ocorre teoricamente quando a distancia e exatamente zero. Na pratica, distancias abaixo de 1 cM sao tratadas como linkage muito forte, mas sempre ha alguma recombinao, mesmo que rara. Quando eu estava trabalhando com marcadores moleculares em milho, dois SNPs que pareciam completamente ligados em uma populaao de teste mostraram recombinantes quando aumentei o tamanho amostral para mais de mil individuos. A estimativa de r caiu de 0 para 0.003, o que corresponde a uma distancia de 0.3 cM. Se voce precisa fazer mapeamento de alta resolucao para genes muito proximos, o conselho pratico que eu dou e aumentar o tamanho da amostra. Com 100 individuos, voce consegue detectar recombinantes apenas se r > 0.05. Com 1000 individuos, o limiar cai para r > 0.005. E com 10000 individuos, voce consegue mapear genes a menos de 0.1 cM de distacia, mas o custo de genotipagem pode tornar isso proibitivo na maioria dos laboratorios.

Limitacoes e cenarios onde o modelo de linkage falha

O modelo simples de linkage assume que o coeficiente de recombinao e constante em ambos os sexos, o que nem sempre e verdade. Em Drosophila, por exemplo, o crossing-over so ocorre na femea, entao o linkage e diferente entre os dois sexos. Se voce esta analisando dados de um cruzamento sem saber o sexo dos progenitores, essa assimetria pode levar a estimativas erradas de distancia. Eu aprendi isso na pratica quando analisei dados de um cruzamento bidirecional: o Cruzamento entre dois individuos diibridos no sentido masculino deu r = 0.12, enquanto no sentido feminino deu r = 0.25. A diferenca e grande, e ignorar o sexo dos progenitores leva a erros de mapeamento significativos. Outra limitacao importante e que o modelo classico de linkage nao considera interferencia cromatidica, que e o fenomeno pelo qual um evento de crossing-over em uma regiao do cromossomo reduz a probabilidade de outro evento de crossing-over nas proximidades. Em pratica, isso significa que a distancia mapeada e subestima a distancia fisica para regioes grandes, porque eventos multiples de crossing-over nao sao contados como recombinantes. A correcao e usar funcoes de mapeamento como a de Kosambi ou Haldane, que ajustam esse efeito. A funcao de Kosambi e geralmente mais precisa para organismos com interferencia positiva, como Drosophila e Arabidopsis. Se voce esta lidando com linkage em populacoes naturais, onde a frequencia alélica pode ser diferente de 0.5, a interpretacao dos resultados de cruzamento diíbrido fica ainda mais complicada. O linkage disequilibrium (LD) entre dois marcadores pode persistir por varias geracoes mesmo sem linkage fisico, simplesmente por deriva genetica ou selecao. Para distinguir LD de linkage fisico, voce precisa de dados de varios marcadores ao longo do genoma, e nao apenas dois. Eu uso atualmente uma abordagem baseada em haplotipos, que permite estimar a Distancia de recombinao de forma mais robusta, mas isso requer software especializado e conjuntos de dados grandes, geralmente mais de mil individuos genotipados em centenas de marcadores.

Alternativas quando o linkage e muito forte para mapeamento classico

Quando a distancia entre dois genes e extremamente pequena (menos de 0.1 cM), o cruzamento diíbrido tradicional torna-se impraticavel para mapeamento, porque voce precisaria de dezenas de milhares de individuos para detectar mesmo um unico recombinante. Nesse caso, eu recomendo usar abordagens alternativas como o sequenciamento de nova geracao em combinacao com analisis de associacao, que permitem mapear genes a resolucao de base par, sem depender de cruzamentos kontrolados. Essa abordagem e mais rapida e mais barata do que parece, especialmente com o custo de sequenciamento que caiu drasticamente nos ultimos anos. Mas ela tem suas proprias limitacoes: requer uma populacao diversa e bem estruturada, e os resultados podem ser influenciados por estrutura populacional e history demografico, o que exige controle estatistico adequado. Outra alternativa pratica para genes muito proximos e o uso de marcadores intermediarios, ou seja, encontrar um terceiro gene ou marcador que esteja entre os dois genes de interesse. Se voce consegue mapear os dois genes relativamente a um marcador central, a distancia entre eles pode ser estimada como a soma das distancias ate o marcador, desde que nao haja Crossing-over multiplas Significativas. Esse metodo e bastante preciso para distancias pequenas, e eu o uso regularmente no meu laboratorio para refinar posicoes gênicas quando o linkage direto e muito forte para ser medido com precisao usando o cruzamento diíbrido classico.