O Crescimento De Uma Cultura De Bactérias

Como monitorar o crescimento de uma cultura de bactérias

Se você já trabalhou com cultura bacteriana em laboratório, sabe que o processo não é tão simples quanto plantar uma bacteria e esperar que ela se multiplique. Existem variáveis que podem estragar tudo rapidamente, desde a temperatura até a concentração de nutrientes no meio de cultura. O o crescimento de uma cultura de bactérias depende de uma série de fatores que precisam ser monitorados com precisão. O crescimento bacteriano ocorre em fases distintas: lag, log, estacionária e morte. A fase lag é quando as bactérias se adaptam ao novo ambiente. Durante esse período, não há aumento significativo na população. Depois vem a fase log, onde a multiplicação é exponencial. As bactérias se dividem no menor tempo possível. A fase estacionária acontece quando os nutrientes começam a se esgotar e os resíduos se acumulam. Por fim, na fase de morte, mais bactérias morrem do que nascem. O período de geração varia conforme a espécie. E. coli, por exemplo, pode levar cerca de 20 minutos para se dividir em condições ideais. Outras bactérias, como Mycobacterium tuberculosis, levam até 18 horas. Esse detalhe é importante porque define a janela de tempo que você tem para coletar dados.

Montando o experimento

Para iniciar uma cultura bacteriana, você precisa de um meio de cultura adequado. O mais comum é o meio LB, que contém extrato de levedura, peptona e NaCl. A proporção padrão é 10g de peptona, 5g de extrato de levedura e 10g de NaCl por litro de água destilada. Autoclave a 121°C por 15 minutos. Deixe esfriar até cerca de 50°C antes de usar. Inocule uma colônia isolada em um tubo com 5ml de meio LB. Incube a 37°C em shaker orbital a 200rpm. Isso garante oxigenação e homogeneidade. Meça a densidade óptica a 600nm (DO600) a cada 30 minutos durante as primeiras quatro horas. Use um espectrofotômetro calibrado com branco de meio LB puro. Uma DO600 de 0,1 corresponde aproximadamente a 10^8 células/ml. Valores entre 0,4 e 0,8 indicam fase log ativa. Acima de 1,0, a leitura perde precisão devido ao espalhamento da luz. Nesse caso, dilua a amostra e releia.

Problemas práticos que aparecem no dia a dia

Já me deparei com culturas que paravam de crescer no meio do caminho. Uma vez, um lote de E. coli DH5 ficou parado na fase lag por mais de seis horas. A solução foi verificar a qualidade do inóulo. A colônia vinha de uma placa com mais de três semanas. Bactérias armazenadas por tanto tempo entram em um estado de dormência mais profundo. Substituí por uma colônia fresca de uma placa com dois dias e a cultura cresceu normalmente em cerca de 45 minutos. Outro problema comum é a contaminação. Fungos e leveduras crescem muito mais devagar que bactérias, mas quando aparecem, estragam a cultura e comprometem os resultados. Sempre traballhe perto de uma chama ou em fluxo laminar. Esterilize a extremidade dos tubos antes e depois de abrir.

Antibióticos e seleção

Se estiver trabalhando com plasmídeos, adicione o antibiótico correspondente ao meio de cultura. Ampicilina a 100µg/ml é comum para resistência com gene bla. Mas cuidado com a ampicilina. Ela é instável em cultura líquida. A concentração cai pela metade em cerca de 12 horas a 37°C. Se precisar de seleção por mais tempo, use kanamicina a 50µg/ml. É mais estável e mantém a pressão seletiva por dias. Registre todas as leituras em uma planilha. Anote a hora exata de inoculação, a temperatura da incubadora, a velocidade do shaker e o volume do meio. Essa informação parece óbvia no momento, mas semanas depois você vai agradecer por ter registrado cada detalhe. Dados incompletos tornam impossível replicar um experimento ou identificar a causa de um fracasso. A medida de DO600 não distingue células vivas de mortas. Se a cultura entrou na fase de morte, a leitura continua alta mesmo com poucas células viáveis. Para contagem real, use plaqueamento em ágar. Espalhe diluições da cultura e conte as colônias após 16 horas de incubação. O resultado vem em UFC/ml (unidades formadoras de colônia por mililitro). Esse método leva tempo, mas é o único que mostra a viabilidade real.

Também é importante saber que diferentes espécies crescem de formas distintas. Bactérias gram-positivas como Bacillus subtilis tendem a formar agregados. Isso causa variações nas leituras de DO porque os grumos espalham a luz de maneira diferente. Nesse caso, a técnica de plaqueamento é mais confiável.

Considerações finais sobre o crescimento

O crescimento de uma cultura de bactérias parece simples na teoria, mas a prática exige atenção a detalhes que podem parecer pequenos e fazem grande diferença. A qualidade do inóulo, a estabilidade do antibiótico, a temperatura exata da incubação e a calibração do espectrofotômetro são fatores que definem se o experimento funcionará ou não. Monitorar regularmente e registrar tudo permite identificar problemas rapidamente. Se algo não crescer como esperado, a primeira coisa a verificar é a origem da bactéria e a frescor do meio de cultura.