O Que É Ciclo Celular

Análise do ciclo celular na prática

A maioria dos gente que começa a trabalhar com culturas celulares acha que ciclo celular é apenas dividir entre fase G1, S e G2/M. Na prática, é bem mais irritante do que isso. Já perdi duas semanas tentando sincronizar linhagens celulares e descobrindo que o que funcionava para HeLa simplesmente não funcionava para MDCK. A sincronização por starvation de soro pode desacelerar as células, mas elas entram em G0, não em G1 ativo. Você acha que está sincronizando e no final o histograma de citometria fica com um pico de G1 duplo que não faz sentido biológico. O ciclo celular é o conjunto ordenado de eventos que uma célula percorre desde sua formação até se dividir em duas células filhas. Ele é dividido em quatro fases principais: G1 (crescimento e preparação), S (síntese de DNA), G2 (preparação para mitose) e M (mitose em si, que inclui prófase, metáfase, anáfase e telófase). Entre a mitose e o início de G1 existe um estágio curto chamado G0, onde a célula entra em quiescência. Células diferenciadas como neurônios e miócitos cardíacos ficam ali para sempre, a menos que haja uma lesão que force regeneração. O controle desse processo depende de ciclinas e quinases dependientes de ciclinas (CDKs). A combinação de ciclina D com CDK4/6 opera no check Point de restrição de G1. A ciclina E com CDK2 empurra a transição para a fase S. A ciclina A com CDK2 mantém a replicação em andamento, e a ciclina B com CDK1 governa a entrada em mitose. Os complexos APC/C e CDH1 são os responsáveis por degradar as ciclinas e permitir a saída da mitose. Se algum desses pontos falha, o resultado é quase sempre aneuploidia ou apoptose.

Checkpoint é o termo que descreve os mecanismos de verificação que impedem a progressão do ciclo quando há dano no DNA ou erro de alinhamento dos cromossomos. O principal é o checkpoint do fuso mitótico, monitorado pela proteína MAD2 e BUBR1. Se um cromossomo não estiver corretamente ligado ao fuso, a célula não anima a anáfase. Esse mecanismo é alvo de muitos quimioterápicos, como a vinblastina e o paclitaxel.

Como medir na prática

O método mais comum é citometria de fluxo com propídeo íodeto ou DAPI. Você fixa as células em etanol 70% a -20°C por pelo menos 2 horas, tratta com RNase A para remover RNA que poderia interferir na fluorescência, e lê no citômetro. O software gera um histograma de intensidade de fluorescência proporcional ao conteúdo de DNA. G1 aparece como um pico com quantidade 2N, G2/M como um segundo pico com 4N, e a área entre eles representa as células em fase S. O problema é que células grandes ou com granulosidade elevada distorcem o pico de G1. A luz espalhada para frente (FSC) e para os lados (SSC) precisam ser ajustadas para descartar detritos e aglomerados. Eu costumava aplicar um gate baseado em FSC vs SSC antes de correr o análise de DNA. Sem isso, o pico de G1 pode parecer mais largo do que realmente é, e você interpreta errado a proporção de células em cada fase. Outro detalhe prático: a concentração de propídeo íodeto importa. Cerca de 50 µg/mL com 0,1% de Triton X-100 funciona para a maioria das linhagens, mas células com membrana mais resistente, como algumas linhas primárias, precisam de concentração maior ou tempo de permeabilização maior. Testei com linfócitos e 50 µg/mL deixou metade das células coradas mal. Aumentei para 100 µg/mL e adicionei 30 minutos de incubação com Triton 0,5%. O histograma melhorou drasticamente.

Dicas que ninguém conta

Muita gente acha que todas as células em cultura estão ciclando ativamente. Isso raramente é verdade. Se o confluência estiver acima de 80%, a maioria das células já entrou em G0 por contato célula-célula. Para obter um ciclo bem distribuído, é preciso semear em densidade baixa e coletar as células na fase logarítmica de crescimento. Colheita fora desse janela pode fazer seu histograma mostrar mais de 70% de células em G0/G1, o que não significa necessariamente algo patológico — pode significar apenas que você esperou demais. Um ponto contra-intuitivo é que o índice de labelling com BrdU ou EdU não é linear com a fração de células em S. Se você adicionar o análogo por 30 minutos e tiver 30% das células em fase S, o índice de marcação vai ser muito menor que 30%, porque apenas as células que estavam efetivamente sintetizando DNA naquele instante vão incorporar. Para calcular o tempo médio da fase S, você precisa de marcações de tempo diferente — 15, 30, 60 minutos — e interpolar. Não adianta usar um único ponto. Outra armadilha comum: usar colchicina para acumular células em metáfase. A colchicina bloqueia a polimerização de microtúbulos e para as células na metáfase, o que é útil para cariótipo. Mas ela não para o ciclo propriamente dito; ela apenas congela a progressão. Se seu objetivo é analisar a proporção de fases, usar colchicina vai inflar artificialmente o pico de G2/M no seu histograma e destruir a realidade biológica da amostra.

Quando o método falha

Citometria de fluxo com PI é rápida, mas não distingue apoptose precoce de células em G1. Células apoptóticas perdem integridade membranar e o PI entra, mas o DNA já está fragmentado, então o pico aparece na região de sub-G1. Se você tem uma amostra com alto índice apoptótico, o sub-G1 pode ser confundido com G1 normal se o gate não for bem definido. A solução é combinar com anexina V-FITC. O gate anexina V positivo menos PI negativo identifica apoptose precoce, enquanto anexina V positivo e PI positivo identifica necrose tardia. Para células primárias ou tecidos sólidos, a digestão enzimática pode alterar a distribuição do ciclo. Colagenase e tripsina em excesso geram estresse e morte celular, enviesando o resultado. Um workaround que funciona razoavelmente bem é usar dispase em vez de tripsina paraDigestão de tecido epitelial, seguida de fixation em etanol frio imediatamente após a dissociação. Reduz o viés de stress em cerca de 15 a 20% comparado ao protocolo padrão com tripsina 0,25% por 5 minutos.

Software de análise

O FlowJo ainda é o padrão do setor, mas é caro. O WinMDI é gratuito e suficiente para histogramas simples de DNA content. Para modelos mais complexos com sobreposição de picos, o software modFit LT oferece ajuste de curva gaussiana que funciona bem quando os picos de G1 e G2/M estão sobrepostos, o que acontece com frequência em linhagens com alto índice de proliferacao e fase S longa. A limitação é que ele assume distribuição normal dos picos; se seu pico de G1 estiver assimétrico por causa de debris ou células duplas, o modelo falha e você precisa ajustar manualmente. Uma alternativa open source é o R com o pacote flowCore. A curva de ajuste fica mais trabalhosa, mas permite automação em lote e reprodução exata do método. Se você processa mais de 50 amostras por semana, vale o investimento inicial de aprendizado. O ganho de tempo costuma ser de horas para minutos por lote.

Resumo sem resumo

O ciclo celular é um processo regulado por ciclinas e CDKs com checkpoints críticos. Na prática, a análise por citometria de fluxo exige cuidado com fixação, permeabilização, gating e interpretação de sub-populações. Métodos de sincronização podem introduzir artefatos. Células em confluência alta não estão ciclando ativamente. O sub-G1 nem sempre indica apoptose se você não confirmar com anexina V. O software de análise precisa ser escolhido conforme a complexidade da amostra. E o que funciona para uma linhagem celular frequentemente não funciona para outra. Teste sempre em controle antes de confiar no resultado.